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2月6日，記者從中國科學院青島生物能源與過程研究所(以下簡稱“青島能源所”)獲悉，該所單碳酶催化研究組首次開發出工程化P450酶，成功實現了不飽和烴的直接硝化，進而通過晶體學研究和自由基捕獲與控制實驗，揭示了直接硝化反應機理。這一研究成果不但為生物催化硝化開辟了新的途徑，而且為促進P450工程酶的過氧化物酶功能在合成化學和合成生物學領域的應用提供了新思路。相關研究成果近日已在線發表于國際期刊《德國應用化學》。

硝基化合物作為一種高附加值的化工中間體，在醫藥、農藥、炸藥等領域均有廣泛應用。目前工業硝化具有產物選擇性差，環境污染嚴重以及反應條件苛刻等多種缺陷。盡管條件溫和的生物硝化方法是值得期待的可替代途徑，然而自然界已知的硝化酶僅有N-加氧酶、過氧化物酶和細胞色素P450酶幾種，且普遍存在催化效率低、底物譜窄和產物區域選擇性差等不足，遠遠不能滿足工業應用的需求。因此開發新型生物硝化酶具有重要意義。

近年來，青島能源所單碳酶催化研究組在國際上首次提出雙功能小分子(DFSM)協同P450酶催化概念，成功構建了人工P450過加氧酶催化體系，實現了氣態烷烴分子的選擇羥化、苯乙烯的高度R-對映選擇性環氧化、碳-氫鍵區域和立體多樣性選擇羥化。此外，研究人員利用酶化學機制指導的蛋白質工程策略，成功開發出雙功能分子協同P450催化的過氧化物酶新功能，拓展了P450酶的化學應用空間，為開發碳-氫鍵氧化官能化提供了新策略。

機制引導的蛋白質工程策略實現P450酶催化不飽和烴直接硝化。王曦翎、叢志奇制圖

研究人員在上述工作基礎上，運用酶工程技術，在過氧化反應中起關鍵作用的氨基酸位點引入空間位阻效應，阻止底物靠近活性中心發生過加氧反應，強化其過氧化物酶功能，首次開發出工程化P450酶，成功實現了不飽和烴的直接硝化。通過疊加底物口袋關鍵位點突變，使底物譜范圍覆蓋19個芳香化合物和9個末端芳基烯烴化合物，獲得了迄今為止催化效率最高、底物范圍最廣的人工P450硝化酶。其中4-氟苯酚的硝化活性最高，其半制備反應的分離產率達到49%。

關鍵詞： 不飽和烴 過氧化物酶 研究人員 催化效率 蛋白質工程